酚接枝聚葡萄糖醛酸在生物墨水中的应用
本文开发了酚接枝聚葡萄糖醛酸(PGU-Ph),通过与酪胺共轭获得,其水溶液可在辣根过氧化物酶(HRP)催化下凝胶化。2.0 w/v% PGU-Ph 溶液(含 5 U/mL HRP)能成功打印出形状保真度高的水凝胶结构,包裹的小鼠成纤维细胞和人肝癌细胞打印后存活率约 95%,并存活 11 天。该研究证实 PGU-Ph 在组织工程,尤其是挤出式 3D 生物打印油墨中具有巨大潜力。
思维导图
详细总结
一、研究背景与目的
<聚葡萄糖醛酸(PGU)特性<:由 Sinorhizobium meliloti M5N1CS 菌株产生的高分子量葡萄糖醛酸均聚物,具有生物相容性、免疫刺激等多种生物活性,且微生物来源使其生产不受环境因素影响。
<研究目的<:合成酚接枝 PGU(PGU-Ph),通过 HRP 催化凝胶化制备生物墨水,应用于挤出式 3D 生物打印,评估其在组织工程中的潜力。
二、材料与方法
<PGU 生产<:在 20 L 生物反应器中培养菌株,离心、超滤纯化后冻干获得 PGU。
<PGU-Ph 合成<:在 MES 缓冲液中,通过 WSCD/NHS 活化,将酪胺共轭到 PGU 上,丙酮沉淀纯化,1H NMR 和 UV-Vis 表征。
<性能测试<
<流变学<:HAAKE MARS III 流变仪测量剪切速率 - 粘度曲线。
<凝胶时间<:在 48 孔板中,HRP 和 H₂O₂触发凝胶化,磁搅拌受阻时为凝胶点。
<机械性能<:EZ-test 测量压缩力,计算 Young's 模量。
<细胞实验<:CCK-8 法评估细胞存活率,荧光染色观察细胞形态。
<3D 打印<:改装 Bio X 系统,27 号针头挤出,H₂O₂气氛中凝胶化,评估形状保真度和细胞 viability。
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三、关键结果
PGU-Ph 合成表征
1H NMR:PGU-Ph 在 6.7-7.2 ppm 出现酚羟基峰。
UV-Vis:275 nm 处出现酚羟基特征吸收峰,Ph 含量为 3.7×10⁻⁴ mol-Ph/g PGU-Ph。
溶液与凝胶特性
剪切稀化:2 w/v% PGU-Ph 溶液在 1 s⁻¹ 时粘度约为 1 w/v% 的 8 倍,随剪切速率增加粘度显著下降。
凝胶时间:2 w/v% PGU-Ph+5 U/mL HRP+1 mM H₂O₂时凝胶时间为 3.5 s,随 PGU-Ph 和 HRP 浓度增加而缩短,随 H₂O₂浓度增加先缩短后延长。
机械性能:2 w/v% PGU-Ph hydrogel 的 Young's 模量为 2.0 kPa,随 HRP 和 H₂O₂浓度变化呈现先升后降趋势。
细胞相容性
溶液实验:0.5 w/v% PGU-Ph 对 10T1/2 细胞线粒体活性无显著影响,存活率与 PGU 相当,高于海藻酸盐(Alg)。
水凝胶实验:PGU-Ph 单用水凝胶细胞粘附性低,与明胶 - Ph 混合后细胞粘附、增殖良好。
3D 打印结果
形状保真度:2 w/v% PGU-Ph 墨水在 H₂O₂气氛中可打印 2 mm 和 10 mm 高度的六边形结构,Young's 模量为 1.5±0.2 kPa。
细胞存活:10T1/2 和 HepG2 细胞打印后存活率分别为 95% 和 94%,存活 11 天,HepG2 细胞形成聚集体。
四、讨论与结论
PGU-Ph 优势:微生物来源易生产,HRP 催化凝胶化快速,细胞相容性好,适合 3D 生物打印。
应用前景:可用于组织工程构建、药物筛选,与明胶 - Ph 混合或引入细胞粘附配体可优化细胞行为。
结论:PGU-Ph 是挤出式 3D 生物打印的有前途材料,为功能性组织构建提供新选择。
关键数据表格
关键问题
问题:PGU-Ph 是如何合成的?
答案:PGU-Ph 通过酪胺与 PGU 的共轭反应合成。具体步骤为:将 PGU 溶解在 MES 缓冲液(pH 6.0)中,依次加入酪胺盐酸盐、NHS 和 WSCD(浓度分别为 45 mM、10 mM、20 mM),室温搅拌 20 小时,然后用过量丙酮沉淀,90% 乙醇 + 10% 水洗涤至无游离酪胺,通过 1H NMR 和 UV-Vis 光谱确认合成成功。
问题:PGU-Ph 在 3D 生物打印中的凝胶化条件是什么?
答案:PGU-Ph 在 HRP 催化和 H₂O₂存在下凝胶化。最佳条件为 2.0 w/v% PGU-Ph 溶液中加入 5 U/mL HRP,在含有 8 ppm H₂O₂的空气中挤出,凝胶时间可缩短至 3.5 秒,形成的水凝胶 Young's 模量为 1.5±0.2 kPa,具有良好的形状保真度。
问题:PGU-Ph 的细胞相容性如何证明?
答案:通过细胞存活率和形态观察证明。10T1/2 细胞在 0.5 w/v% PGU-Ph 溶液中培养 24 小时后,线粒体活性与 PGU 组无显著差异(p=0.45),且高于 Alg 组(p<0.03)。打印后 1 天,包裹的 10T1/2 和 HepG2 细胞存活率分别为 95% 和 94%,并存活 11 天,HepG2 细胞在水凝胶中形成聚集体,证明 PGU-Ph 具有良好的细胞相容性。
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